临床微生物大讲堂第五讲

结核分枝杆菌主讲人：范齐文

1.臭氧消毒可以杀死结核菌吗？

答：想法很好，但是我没有查到相关的文献支持臭氧可以杀死结核菌。

2.4%NaOH消化离心法现在还用吗？

答：此法国内现在还在使用，课件里介绍的方法是台湾使用的。

3.首先感谢范老师的精彩演讲，针对潜伏性结核病的早期诊断，相比较来说哪些检测适合？对于MTB和NTM，用MPT64抗原检测能直接区分？

答：谢谢老师的认可。目前潜伏性结核感染（LTBI）的早期诊断，比较好的方法还是IGRAs，但要结合临床表现及影像学资料联合判断，排除有活动性结核的可能。TST也可以作为LTBI的检测手段，但是不能区分BCG接种导致的假阳性干扰。利用MPT64抗原检测结核分枝杆菌培养液可以区分MTB和NTM，但要注意某些BCG型别的假阴性，不可以鉴别LTBI和活动性TB。

4.请问上述培养方法对于NTM能培养出来吗？

答：无论是固体培养（L-J）还是MGIT都是可以培养MTB和NTM的。

5.2A生物安全柜不可以用于结核实验室吗？

答：如果用来结核菌涂片检测是完全可以的，但是做药敏（高浓度菌液或纯菌）的话建议还是使用B2级别的%外排式BSC，同时配备负压环境，做好生物安全防护。

6.液体培养阳性的标本如果转做固体培养基呢？除了液转固的方法还有其他的好的方法吗？

答：首先，液体培养阳性,抗酸染色证实为抗酸杆菌,即可报告临床分枝杆菌培养阳性,不需要转种固体培养基。液体培养阳性的标本是可以转种固体培养基，但是周期比较长。目前培养方法只有液体培养是最为理想的方法，能做结核培养的商业化系统主要是BDMGIT、TREK两种，也是FDA批准通过的两种系统（仅此两种）。其他的血培养系统也是可以进行结核血培养的。

7.IGRAs阳性肯定是潜伏性结核感染吗？

答：首先要明确一点的是，任何一种方法都有其局限性，不可能敏感性和特异性都达到%。IGRSs也不例外，只不过假阴性的比率非常的低而已。

8.临床工作中发现T-SPOT远没有宣传的好。

答：IGRAs不能区别LTBI和活动性TB，此法比较适合用于发达国家，TB的发病率在发达国家要相对的低很多，使用IGRAs主要是用来筛查LTBI，进行干预治疗以实现消灭结核的目的。我国是TB大国，按照全球1/3感染的比例算，那我国的LTBI可是个惊人的数字，所以会有很多IGRAs阳性的正常人。临床在诊断活动性TB的时候不能单凭此检测结果就下结论，需要结合临床症状和影像学检查综合考虑。因此，IGRAs只能辅助性的诊断活动性TB。

9.非常感谢，请问NTM的生物安全要求是否等同MTB，也就是普通实验室是否可以处理NTM？

答：NTM的致病性要远远的低于MTB，所以一般实验室是可以处理NTM的，但毒力低也不可以轻视，最好还是在BSC内操作。

10.2A生物安全柜不可以用于结核实验室吗？只做涂片和染色。

答：A2级的生物安全柜做染色和涂片足矣。

11.Y-干扰素释放试验能否区分NTM和结核？

答：IGRAs是可以区分NTM的，虽然在一些NTM中也有表达ESAT6和CFP10的，比如堪萨斯、转黄、海分枝、斯赛格分支杆菌等，但可以导致人体发生免疫反应的只有堪萨斯，而堪萨斯在临床很少发生感染，所以可以认为IGRAs是高度特异的。

12.烤片机65℃，30分钟能灭活结核杆菌吗？

答：烤片机65℃也可以起到杀菌作用。

13.T-spot假阴性有多高？有数据吗？

答：WHO发布的指南中，IGRAs诊断活动性TB的阳性率在73%-83%，也就是说，有将近1/4的活动性TB被漏检。

14.针对MPT64抗原检测其灵敏度如何？该检测方法是否存在假阳性的结果？有哪些影响因素引起假阳性？

答：大多数文献报道MPT64抗原的灵敏性在95%以上，特异性在98以上。也有文献的报道结果低于上述比率。任何一个方法都会存在假阳性或假阴性。文献中报道的假阳性，更多的是出现在培养管污染的情况，正常培养阴性的管子偶尔也会出现假阳性，但几率较低，具体是什么原因导致的，原因不明确。如果培养管中的菌量较低，亦或是遇到BCG的4个亚株（MPT64缺失）会出现假阴性。总之，尽量不要使用培养污染的管子进行MPT64的鉴定，会降低检测的效力。

15.pcr检测结核如何评价？如何和痰涂片结核？

答：评价首先需要确立一个评价标准，寻找一个参比方法，通常是以培养结果作为标准，将PCR检测结果和痰涂片结果同培养结果进行比较，痰涂片也可以和PCR结果进行比较。

16.浓缩法会不会有污染?

答：保证浓缩法使用的溶剂是可靠的，做好阴性和阳性对照，严格按照操作规程操作是没有问题的。

17.范老师你好，我们在做天骑科技夹层杯试验，你有对夹层杯法的评价吗？

答：您说的这个夹层杯我没有使用过，不好做出评价。

18.老师好，我想问一下，我们用的是彭氏杯检测，平日里都在生物安全柜里操作，老师说房间也需要保持负压，一定要在负压房间吗？这样的要求对基层来说有点高。

答：我在课件里讲的是如果操作药敏，强烈建议有负压环境，因为在药敏过程中，会制备高浓度的MTB菌液，会产生大量的气溶胶，再好的BSC也不能完全保证不会有气溶胶外泄，所以最好有负压环境，保证气流的定量流动。但如果只是做抗酸涂片和培养的话，没有负压是可以的，但要做好个人防护。

19.次氯酸钠浓缩法比较高压哪个比较方便一点？

答：高压的效果是毋庸置疑的，高压后操作是绝对安全的，但是需要较长的时间。次氯酸钠浓缩法虽然可以杀死MTB，但肯定是没有高压的结果可靠，不能保证所有的MTB都被杀死，但已大大降低了生物风险。操作起来会比较省时方便。

20.谢谢老师的精彩讲解，范老师在课件中提到的tw涂片的方法，是现在用彭氏杯法的结核杆菌集菌法吗？

答：我没有使用过老师说的彭氏杯法，但我想最终达到的目的都是一样的，富集菌落提高阳性率。

21.谢谢范老师精彩演讲，1、请问胸水有什么好的方法固定，平时染色到一半就掉完，到最后镜检就什么都没有了？

2、抗酸染色方法有热染和冷染，请问阳性率哪个高，热染抗酸杆菌永不褪色，冷然容易褪色，平时工作我们应该用那种方法比较好？

3、如果肺结核病人吃药大概一年，临床症状消失，痰涂片阴性，拍片提示还是肺结核，请问这时候是以实验室检验结果为主还是以拍片结果为主，还需要继续治疗吗？

答：1.首先一点是涂片不要太厚，最好用NaOH消化处理，离心后再涂片，玻片要脱脂。钱雪琴老师的做法：将胸水中的凝块絮状物吸到另外一只离心管，剩余标本离心沉淀，去上清，将沉淀物与之前的凝块合在一起，用2倍体积2%-4%NaOH消化半小时，用3-4倍PBS或蒸馏水中和，离心，弃上清，取一滴涂成10mm*20mm大小。消化时以絮状物和凝块完全消失溶解为宜，要漩涡震荡。胸水离心后,如果不消化处理,要避免染色时脱落,涂片做到尽可能薄，最好紫外线照射2个小时，也是可以的.

2.阳性率我没有做过比较，但效果应该是一样的，只是放久了冷染会褪色。至于使用哪种方法，要综合多方面的因素，如果您所在的省份需要阳性MTB涂片保存时间很久，平时标本量不多，那可以使用热染法，反之使用冷染比较好。

3.结核多数会形成空洞的钙化灶，至于是活动性TB还是治愈后存留的空洞，这个就不好说了，要看阅片的临床医生的能力，抗结核治疗一年已经基本可以治愈，前提是在准确药敏结果指导下治疗。涂片转阴，没有临床症状并持续2-3个月，基本可以认为是治愈了。

22.胸水结核菌图片一定需要离心吗？是不是根据胸水性质而定？

答：胸水结核菌涂片最好是离心消化后再涂片，因为胸水中的菌载量通常是比较低的，染色时易脱落,需要离心富集菌再进行检测。胸水量50-ml为宜。

23.个人认为建议国内取消T-SPOT检测，增加涂片检查，加强尤其脑脊液，心包积液，腹腔积液的离心及标准化检测。

答：取消T-SPOT肯定是不可能的，只是要合理使用。涂片毕竟也有局限性，结核的诊断本就是复杂困难的，需要联合多种方法检测。

24.结核TSPOT检测，有时候会碰到阳性阴性对照，以及A，B抗原斑点都有很多点，复查也一样。尤其是风湿科和消化科的病人常见。请问老师们碰到这种情况怎么解释？

答：T-SPOT检测结果判读是数细胞点数，如果遇到一些患者，特别是风湿科的患者，或者是免疫性疾病的患者，其体内T细胞释放的干扰素-γ的量会偏高，即本底偏高，致使阳性对照和阴性对照都出现较多的斑点，造成结果判读的困难。

25.范老师，有一病人去年上半年查出结核，痰涂片也找到抗酸杆菌治疗后好转，今年8月初，又出现咯血，CT看到新的结节状，但痰涂片找不到结核菌，为什么呢？结核菌有没有排菌期？谢谢。

答：1.结核病治愈后是非常容易复发的，因为肺泡巨噬细胞很难将MTB完全清除。还有就是有可能该患者又被传染而发病。有TB的症状但涂片阴性是常见的情况，TB涂片阳性要有一定的前提条件：首先，该患者必须是开放性TB，MTB在患者咳嗽的过程中才能随痰液排出；菌量也是一个重要条件，涂片的敏感性或是检测下限在cfu/ml，如果低于此水平，涂片是检测不出的。另外，每次咳痰也不一定都是从病灶咳出的，因为每次咳痰的力度不同，痰液有可能从不同部位的肺段排出，就会出现时阳时阴的情况。

26.请问老师结核TSPOT检测与PCR检测的优缺点？结核TSPOT检测能检测NTM?

答：T-SPOT前面已经强调过了，是不能区分LTBI和活动性TB，只能作为辅助诊断。PCR快速，特异，灵敏度高，但也存在一定的假阴性。T-SPOT不能检测NTM，堪萨斯会导致假阳性。

27.老师你好，医院现在是高压之后离心涂片，然后镜检，比较次氯酸钠法离心涂片，它们的优缺点是什么？

答：高压后离心,标本没有达到真正的浓缩,会有很多沉淀，耗时长,优点是安全。次氯酸钠法消化痰比较彻底，缺点是离心前不加水稀释，染色时痰膜易脱落。建议：离心前用蒸馏水稀释或不稀释，但要在沉淀中加1：15的血浆1滴。(钱雪琴老师做法)

28.MPB64和MPT64是指一种东西么？我们现在用的结核抗原检测培养物是MTB还是NTM用的就是检测MPB64。

答：MPT64又叫MPB64，叫法不同。

29.如何看待痰涂片抗酸杆菌阳性中的NTM的问题？

答：NTM近年来的发病率程上升趋势，但多数是肺外的NTM感染。NTM抗酸涂片很难通过镜下就将其同MTB区分开，这需要经验非常之丰富的阅片人员，但也不能保证结果完全正确，所以最好不要通过镜检来区分NTM和MTB。

30.NTM的比例大概占多少比例？

答：年全国第四次流调的结果是NTM总感染率为11%，年第五次全国流调的结果为22.9%，10年翻了一倍。

31.次氯酸钠法离心涂片和氢氧化钠处理后离心，它们的优缺点是什么？

答：次氯酸钠处理：

1.安全，

2.对痰的消化比较彻底，

3.非特异性物质增加，对镜检有干扰，

4.不易处理胸腹水、脓、脑脊液和明显的血性穿刺液。

NAOH处理：

1.菌是活菌，存在生物危险，

2.消化痰和尿的能力不如次氯酸钠，

3.非特异性物质少，镜检背景干净，

4.对常见标本均能消化处理。

32.生物安全柜在实验后彻底清场是指什么？用75%酒精擦拭？

答：清场是指在实验结束后对BSC内进行清洁保养，实验前最好在台面铺一层吸水性好的厨房用纸或擦手纸，用70%-75%酒精进行喷洒湿润，再进行操作；实验结束后再喷洒酒精，丢弃垫纸，用酒精全面的喷洒BSC，作用一段时间进行擦拭，最后照紫外消毒半小时以上。最好不要使用次氯酸钠，会对BSC有腐蚀。

33.Xpert检测方法，是一个盒子检测一种耐药吗？对利福平耐药检测是针对RRDR耐药决定区设计探针，那就检测不出非RRDR的利福平耐药检测？

答：Xpert只能检测利福平耐药。其设计的探针也只能检测对利福平是否耐药。因对利福平耐药的MTB,95%也对INH耐药，所以认为对利福平耐药的MTB基本就是MDR。

34.快速生长NTM与缓慢生长NTM的药敏结果差异？

答：快生长的NTM常见有偶发分枝杆菌复合群、龟分枝杆菌/脓肿分枝杆菌、转黄分枝杆菌、齿垢分枝杆菌，其他的基本为慢生长NTM。慢速生长的NTM药敏通常使用MGITTBeXiST检测，快速生长的NTM使用CLSIM24-A2中的MIC法。NTM治疗通常比较困难，往往需要几个月的治疗周期，且结果不理想。快生长NTM应该做药敏的药物有：阿米卡星、头孢西丁、环丙沙星、克拉霉素、多西环素（或米诺环素）、亚胺培南、利奈唑胺、莫西沙星、复方新诺明、妥布霉素。慢生长的NTM，在CLAIM24-A2中有列出海分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌病和鸟分枝杆菌复合群的药敏规则，都是不一样的。有一些NTM的药敏规则尚未标准化。(引自CLSIM24-A2)

35.实验室对NTM的药敏试验有什么好的方法？

答：NTM的药敏我没有做过，个人认为还是参照CLSI-M24-A2的要求来操作吧。

36.消化多长时间？

答：消化15分钟，时间要严格控制，不可过长，否则MTB会发生菌体降解。

37.请问5%次氯酸钠溶液是84液吗？

答：需要看包装上的说明，有效氯的浓度是多少，进行换算。可以用消毒片配置。最好是现用现配，能够保证有效氯的浓度。

38.胸水图片，多少视野查到多少抗酸阳性菌算是阳性？胸水和痰液要求一样吗？

答：胸水涂片等同于痰涂片，找到3条以上。抗酸染色视野，荧光染色50视野。

39.范老师，你好！日常工作的涂片在紫外灯下照一小时对杀死结核分枝杆菌有效吗？染片过程中应注意哪些细节来保护检验者？

答：结核操作规程中的建议是涂片在紫外下照射1小时，对结核分枝杆菌的杀灭应该有效，但我没有做过这方面的验证。既然能作为指导写进指南，应该是没有问题的。

涂片需要注意的：首先要做好个人防护，口罩，手套，帽子等穿戴好，在BSC内操作，高压也好，次氯酸钠富集也好，从中选一个，或者是在紫外下照射后进行染色。

40.消化后加水多少？

答：加消化试剂不超过15ml,再加水至50ml.

41.以上讲的几种方法，都不能明确的区分是潜伏期结核还是活动期结核，是吗？

答：免疫学方法都无法区分LTBI还是活动性TB。

42.老师们请问，谁知道多重耐药菌的耐药趋势图怎么做？

答：这个可以用Excel表格或是专业的绘图软件。

43.我们准备做结核培养，可是没有负压实验室，只配了B2安全柜和通风柜，需注意什么？

答：B2安全柜是%外排的，培养和涂片其实都是差不多的，不会产生高浓度含MTB的气溶胶，只要做好个人防护，如佩戴N95口罩，穿一次性反穿衣等，是可以实现自我防护的。

只有在做药敏的时候，强烈建议配有负压环境。

44.xpert如何收费？

答：这个每个省的收费标准不一样，上海目前还没有收费标准，但计划是申请-0/次。比较贵。

45.有人用过银科的药敏试剂吗？

答：我没有用过，您可以在群里面问问其他的老师。

46.浓缩集菌后还有必要再紫外线照射吗？

答：如果使用5%次氯酸钠的话没有必要。如果使用NaOH，最好要照紫外，在生物安全柜中烤片也行。

47.固体培养基一般4周报阳，做药敏要取2周的菌苔，怎样做到？

答：从固体培养基上生长肉眼可见的菌落开始算起，14天内用于药敏检测，如超过这个期限菌龄较久，会影响药敏结果，特别是吡嗪酰胺的药敏。

48.老师好，您介绍了许多针对MTB的检测技术，针对NTM菌株的鉴定，是否也有相对应的检测方法呢？

答：针对NTM的检测也有很多检测手段，比如HAINGenoTypeMycobacteriumCM/AS，北京博奥公司的诊断芯片等。

49.我们是用84浸泡再离心取沉渣图片！84对结果有影响么？

答：84消毒液的有效氯浓度大概在5.5%-6.5%，浓度有点偏高，如果不稀释的话作用时间要相应的缩短，但杀菌的效果需要做实验来验证。

50.请问现在市面国产结核PCR试剂所测序列都一样吗?我们结核PCR阳性与涂片不是很一致！

答：目前国产PCR试剂盒我没有使用过，但都应是MTB的保守序列，比如rpoB，热休克蛋白65基因等。PCR结果与涂片结果不一致是正常的，因为痰液里存在一些PCR反应酶抑制剂，有时会导致假阴性。有时因为阅片的原因（漏检）涂片会假阴性，等等，都会导致两种方法的结果不一致。

51.胸腹水、脑脊液，可以也用次氯酸钠处理吗？

答：不可以消化胸腹水，次氯酸钠适合消化痰和尿标本，次氯酸钠消化胸水后涂片，不易脱色。脑脊液没试过。

52.请钱老师再把胸腹水、脑脊液的处理方法详细说一下，谢谢！

答：胸腹水请参见问题21，淡黄色或有絮状物的脑脊液，用等量2%-4%的NAOH消化，蒸馏水稀释至50ml，离心取沉淀涂片,澄清透明的脑脊液离心后，直接涂片，不需消化处理。

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